I kampen mod SARS-CoV-2: Sådan bruges spildevand til national overvågning af sygdomsudbrud
De fleste af os har formentligt forholdt sig til, hørt om eller talt om “Corona” og ”Covid-19” hver evig eneste dag siden epidemiens fødsel. Virussen, SARS-CoV-2, som giver anledning til sygdommen Covid-19, blev en verdensomspændende pandemi tilbage i 2020, og har siden da florereret i langt de fleste dele af verden. SARS-CoV-2 og sygdommen Covid-19 har haft ekstremt store menneskelige, såvel som økonomiske konsekvenser.
På den positive side, har Covid-19 i den grad bevist, hvordan mennesker, på tværs af landegrænser kan udvikle nye teststrategier og vacciner på rekordtid. Allerede tidligt i pandemien blev PCR-analysemetoden anvendt til at verificere infektion med SARS-CoV-2 fra kliniske prøver, dem vi kender fra podning af hals eller næse. Antigen-testen blev dernæst udviklet som et hurtigere og mindre økonomisk omfattende alternativ til påvisning af SARS-CoV-2 samt til sygdomsudredning.
Et af de store problemer med de kliniske testmetoder er dog, at de er begrænset af et lands testkapacitet samt befolkningens villighed til at lade sig teste. Det er her, spildevandsovervågning kommer ind i billedet som et effektivt redskab til overvågning af SARS-CoV-2 virus i et afgrænset område. SARS-CoV-2 frigives fra størstedelen af inficerede personer under toiletbesøg (i den faste fase), endda ofte inden inficerede personer begynder at udvikle symptomer. Således kan RNA fra SARS-CoV-2 genfindes i spildevandet og give et godt billede af smittetrykket i et givent område.
Figur 1: Den 25.04.2021 blev figuren "Coronatest af spildevand" tegnet af Julius. Denne figur var med til at øge fokus på det enorme anvendelsespotentiale, som denne type overvågning har. Siden da er fokus fortsat øget, og Danmark har i dag en omfattende national overvågning af SARS-CoV-2 i spildevand i hele landet med 220 prøvetagningssteder, som testes 3 gange ugentligt samt daglig overvågning af alle landets lufthavne. Vi er stolte af, at alle disse analyser foretages hos Eurofins Miljø laboratorium i Vejen.
Spildevandets rejse
Figur 2: Spildevandets rejse. Spildevand kan udtages fra individuelle bygninger såsom boligkomplekser, plejehjem eller virksomheder, eller fra renseanlæg der modtager vand fra opland og byer. Illustrationer fra freepik.com.
Spildevand findes i alle kloaker hele landet over, og der produceres dagligt mange tusinde liter. Spildevandsprøver kan udtages alle steder, hvor der er en brønd. De fleste prøver i Danmark udtages fra indløbet til renseanlæg, og en spildevandsprøve herfra dækker mellem 1.000-535.000 personer. I de største byer i Danmark er byen inddelt i mindre områder, for at få et mere detaljeret billede af forekomsten af SARS-CoV-2 og dermed smittetrykket.
I disse situationer udtages spildevandsprøverne i oplandet af kloaknette. Det kan foregå på pumpestationer eller ved decentrale placeringer af prøvetagningsudstyr på ledningsnettet. Et eksempel kan være Lynetten Renseanlæg i København, det modtager spildevand fra 535.000 personer fordelt på 8 kommuner. For at identificere hvilken kommune eller hvilke områder i kommunerne, der faktisk bidrager med COVID-19 viruspartikler til spildevandsprøverne, er det derfor muligt at udtage prøver i oplandet af kloaknettet. Det er endvidere muligt at lave endnu mere specifikke prøvetagninger i områder, hvor det er særligt vigtigt, at der ikke er COVID-19. Dette kan eksempelvis være fra plejehjem, efterskoler, sygehuse mv. eller virksomheder, der har en kritisk drift. For at sådanne prøver giver mening, kræver det dog at brugerne anvender toiletfaciliteterne, og rent praktisk kræver det ligeledes at der er en tilgængelig kloakbrønd.
Prøvetagningen foregår ved at udtage prøver over et døgn. Dette kan ske på to måder. På renseanlægget udtages prøverne som flowproportionelle døgnprøver, dvs. der udtages en delprøve på 50-100 ml for hver f.eks. 10m3 spildevand, der ledes ind på renseanlægget. Dette er den bedst egnede prøvetagningsmetode. På alle øvrige steder er prøvetagningsbrøndene udformet, så det er vanskeligt eller ofte umuligt at udtage flowproportionelle prøver. Prøverne udtages derfor ved en såkaldt ”tidsproportionel” metode, som betyder at der udtages delprøver løbende (50-100 ml spildevand hvert 15 minut), over 24 timer, for at opnå en repræsentativ prøve fra et givent område. Efter prøven er udtaget, transporteres den til os i Eurofins Miljø, hvor vi først homogeniserer hele prøven og derefter neddeler prøven til et mindre volumen, som vi kan arbejde videre med.
Kort fortalt så starter vores analyse med, at spildevandsprøven ankommer til laboratoriet hen på eftermiddagen. Her registreres alle prøver, hvorefter de grundigt homogeniseres og neddeles ved at hælde spildevand ud i mindre beholdere på 50 ml. Herefter starter analysen med, at vi fjerner slam og suspenderet stof fra prøverne ved at centrifugere. Den solide fase fjernes, idet slam og suspenderet stof indeholder en række komponenter, der har inhiberende effekt på den senere analyse. Ved denne indledningsvise centrifugering slynges det solide stof således til bunden af beholderen, hvorefter vandfasen kan hældes til en ny beholder. For at sikre at vi kun tager vandfasen med videre, hældes kun 40 ml spildevand videre til en ren 50 ml beholder, og det solide stof i bunden af beholderen kasseres. Herefter skal SARS-CoV-2 i prøverne ”fanges” ved hjælp af en flokkulerende væske, kaldet PEG (polyethylen glykol). PEG er en polymer, som bruges til at fange eller fælde viruspartikler i en vandig matrice, og er anvendt til nedfældning af SARS-CoV-2 flere steder i verden. Efter tilsætning af PEG rystes prøverne på et rystebord ved køleskabstemperatur, for at sikre at alle vira ”fanges”. Dernæst centrifugerer vi igen, men denne gang ved højere hastighed og i længere tid. Under denne centrifugering slynges alt virus til bunden af beholderen, indkapslet i PEG polymeren. Efter endt centrifugering hældes vandfasen forsigtigt fra, og den lille PEG og virus klat i bunden af røret tages med videre i analysen. Denne klat, populært kaldet ”pellet,” opløses dernæst i lysis buffer, som er en lyserende væske, der nedbryder SARS-CoV-2’s cellevæg og frigiver virus RNA. Derefter fanges RNA ved brug af magnetiske beads, vaskes tre gange i forskellige ethanol-baserede vaske buffere, og opløses til slut i en stabiliserende buffer, således RNA’et forbliver stabilt indtil senere analyse.
Lidt af det tekniske - hvordan påvises SARS-CoV-2?
For at kunne påvise SARS-CoV-2 i spildevand, drager vi nytte af, at forskere rundt om i verden allerede har fuld-genoms-sekvenseret SARS-CoV-2, kortlagt genernes lokation og fundet ud af, hvilke regioner på SARS-CoV-2 genomet, der er tilpas konserverede til at kunne fungere som genetiske markører. Med en håndfuld genetiske markører i baghånden, kan man så udvikle såkaldte ’primere,’ der modsparer den genetiske kode hos SARS-CoV-2, netop på den pågældende markørs lokation. Herefter kan man så gøre brug af PCR-metoden (Polymerase Chain Reaction) som opformerer de ønskede RNA stykker til en detekterbar koncentration. Fordi SARS-CoV-2 er en RNA-virus, og ikke har DNA som arvemateriale, er der dog brug for et ”reverse” trin, såkaldt RT (Reverse Transcriptase), som omdanner RNA til DNA, og derefter kan den pågældende genetiske region hos SARS-CoV-2 opformeres. Under hver cyklus i PCR reaktionen (kendetegnet ved en serie af forskellige temperatur-skift som gentages et ønsket antal gange), fordobles SARS-CoV-2 RNA sekvenserne. Ved hver fordobling aktiveres et lille flourosens signal, som maskinen så måler under hele processen (se figur 3). Denne kontinuerlige måling af flourosens kaldes qPCR. Når flouroscens er tilstrækkeligt høj, kan vi måle tilstedeværelsen af SARS-CoV-2’s RNA, og endda kvantificere til et omtrentligt antal SARS-CoV-2 RNA genomkopier i spildevandet.
Figur 3: Grafisk illustration af PCR konceptet. Under PCR opformeres RNA fra eksempelvis SARS-CoV-2, hvor hver virus kopi fordobles for hver gennemført cyklus. Et lille fluorosens signal aktiveres ved hver fordobling, således tilstedeværelsen af SARS-CoV-2 virus til sidst kan detekteres.
I Eurofins Miljø arbejder vi i dag med tre genetiske markører for SARS-CoV-2, nemlig det såkaldte RdRP-gen, som er et RNA-afhængigt RNA-polymerase gen, samt to regioner på N-genet (N1 og N2) som er et nucleocapsid gen. På figur 4 ses et SARS-CoV-2 virus, med sine karakteristiske spile glycoproteiner på overfladen samt diverse vigtige proteiner. Derudover ses den genetiske opbygning af SARS-CoV-2. Her ses at RdRP genet er placeret på ORF1b sekvensen, mens generne N1 og N2 er lokaliseret på N gen regionen. Forskellige labs verden over måler på forskellige gensekvenser, men fælles for alle labs er, at der altid måles på mindst to gener, for at mindste risikoen for falske negative prøver.
Figur 4: Den genomiske opbygning af SARS-CoV-2, hvor størstedelen af de PCR baserede test gør brug af genetiske markører der rammer RdRP-genet (lokaliseret på ORF1b) samt to regioner på N-genet (N1 & N2). Figur fra Ward et al 2020.
Kan vi også følge med i, hvilken SARS-CoV-2 variant der er hvor?
Kort fortalt – ja det kan vi faktisk godt.
Virus, som SARS-CoV-2, har som alle andre virus, den egenskab at den kan mutere på kort tid, hvilket giver virus øgede ”overlevelsesmuligheder,” idet nogle mutationer leder til højere transmission (smitte), er bedre til at inficere værtsorganismer, eller ligefrem udvikler mekanismer til at undvige de nuværende vacciner. Derfor er sundhedsmyndighederne meget opmærksomme på at følge forekomsten, og spredningen, af nye varianter af SARS-CoV-2.
Vi har i Danmark oplevet op til flere skift i virusvarianter. Gennem sommeren 2021 oplevede vi et skift fra den daværende dominerende Alpha-variant til den mere konkurrencedygtige Delta-variant. I modsætning til Alpha-varianten, havde Delta-varianten den ”fordel” at den kunne spredes hurtigere, især fordi infektion med Delta ledte til højere virus-load (viral load) i inficerede patienter.
Det seneste eksempel på variantskift i Danmark, er skiftet fra Delta-varianten til den meget smitsomme Omiron-variant, som fandt sted mellem jul og nytår 21/22. Omikron viste sig ligeledes at være endnu mere smitsom end de tidligere SARS-CoV-2 varianter. Omikrons ”fordel” var dog, i modsætning til de tidligere varianter, at den forårsager mildere symptomer, hvilket øger vores fysiske interaktioner, og dermed giver Omikron gode muligheder for at finde nye værter.
Hos Eurofins Miljø har vi fulgt forekomsten af virusvarianter i spildevandet nøje. Vi kan nemlig detektere nogle af de mest karakteristiske mutationer i både Alpha- (A570D), Delta- (L452R) og Omikron- (K417N) varianterne. Allerede i slutningen af november 2021, inden Omikron rigtig fik fat, var vi her hos Eurofins Miljø i stand til at påvise tilstedeværelse af netop denne variant i tre forskellige lokalområder. Dette gav SSI mulighed for at intensivere smitteopsporingen tidligt i forløbet og udpege hvilke kliniske test, der skulle hel genoms sekvenseres. Over de følgende uger kunne vi så, som bekendt, konstatere at Omikron-vairanten spredtes med lynets hast gennem den danske befolkning, og hurtigt fik udkonkurreret Delta-varianten. Allerede mellem jul og nytår kunne vi, via. spildevandet, konstatere at Omikron udgjorde mere end 80% af smitten på landsplan.
Figur 5: Skift i SARS-CoV-2 varianter i Danmark. Først et gradvist skift fra Alpha til Delta i sommeren 2021, og efterfølgende et ekstremt hurtigt skift fra Delta til Omikron mellem jul & nytår 2021.
Ved at detektere karakteristiske mutationer i SARS-CoV-2 varianter er vi således i stand til, allerede tidligt i forløbet, at udpege områder med smitte af nye, potentielt truende SARS-CoV-2 varianter. En tidlig præcisering af smitte med nye varianter i lokalområder kan således være altafgørende for, om en ny variant af SARS-CoV-2 rent faktisk spredes, samt for hvor hurtigt spredningen sker. Hvis de rette tiltag, restriktioner og testregimer implementeres tidligt i forløbet, kan fremtidige udbrud af nye SARS-CoV-2 varianter forhåbentlig reduceres, hvis ikke helt undgås.
Hvordan ser fremtiden ud?
SARS-CoV-2 har ændret mange ting. En vigtig ændring er dog den ”Danske epidemi-lovgivning”, og et stort fokus på anvendelsesmulighederne indenfor national overvågning af spildevand. Både politikere, medier og privatpersoner har endelig fået øjnene op for potentialet af sygdomsovervågning af spildevand, som en særdeles kost-effektiv metode til at overvåge befolkningen for SARS-CoV-2. Metoden har utvivlsomt langt flere anvendelsesområder, og vi her i Covid-udviklingsgruppen sidder ikke stille. Vi er i fuld gang med at undersøge, om man kan detektere andre sygdomme i spildevandet, såsom Influenza A og B, RS-virus eller noget helt tredje. Vi tror på, at spildevandsundersøgelser kan bidrage med brugbar viden om hvilke sygdomme, der cirkulerer i lokalområder. En tidlig varsling om ændringer i virusindhold via spildevandet kan således give anledning til implementering af passende forholdsregler, og specificere hvor persontest (og eller vaccination) bør igangsættes hurtigst muligt.
Vi håber, du har nydt (læse)turen og lært en masse om anvendelsen af spildevand til sygdomsovervågning!
