Non-target screening

“Non-target, untarget, chemical fingerprinting” – kært barn har mange navne, men der er ingen tvivl om, at vi i de kommende år kommer til at høre meget mere til denne analyseplatform.
Lige vinder den nemlig frem på miljøområdet efter i en række år primært at have været kendt i forskerkredse og til analyser på blandt andet retsmedicinske problemstillinger.   

Baggrunden for brugen af non-target på miljøområdet ligger egentlig lige for. Metoden gør det muligt, at screene for langt flere stoffer end vi gør i dag med de traditionelle såkaldte target-analyser. En grundlæggende svaghed ved den nuværende måde at undersøge for uønskede stoffer i miljøet er, at der kun undersøges for en meget lille delmængde af de kemikalier, som anvendes i f.eks. husholdningerne, industrien eller indenfor lægevidenskaben. Eksempelvis opererer vandrammedirektivet i øjeblikket med 45 prioriterede stoffer. Til sammenligning anvendes der anslået 100.000 kemiske stoffer i industrien ligesom der kommer et meget stort antal nye stoffer til hvert år.

Her vil vi give dig et indblik i principperne bag non-target analyser samt komme ind på, hvor vi ser, at metoden kan blive brugt i fremtiden.

Du har også mulighed for at se vores webinar om QTOF teknologien og non-target screeninger. Du finder webinaret her.

Forskellen på target, suspekt og non-target analyser

De teknikker, som anvendes i dag, er stort set alle sammen såkaldte target-analyser. Det betyder i praksis, at der analyseres for et eller flere allerede kendte stoffer. Der anvendes typisk kommercielt tilgængelige og sporbart certificerede referencer med kendt indhold til at verificere identifikationen af de fundne stoffer og til at kvantificere de fundne koncentrationer. Analyseusikkerheden kan bestemmes eksakt og ligger typisk i størrelsesordenen 10-20% (K=1 niveau).

Detektionsteknikker

Den mest almindelige anvendte detektionteknik i dag til organisk mikroforurening er lavresolution massespektrometri koblet med enten gaskromatografi eller væskekromatografi. Her anvendes ofte quadrupoler eller triple quadrupoler til at bestemme masse over ladning af de analytter, der søges efter. Quadrupolen fungerer ved at søge over én masse-over-ladning (m/z) ad gangen. Ved at placere en detektor efter quadrupolen er det muligt at opnå et elektrisk signal, som kan sammenkoble intensitet med den masse, der er tilladt passage i quadrupolen. Nyere quadrupoler kan separere masser ned til <0,35 m/z. Ved at sammenholde masse og tidsseparation er det muligt at identificere et stof. For at øge sikkerheden af identifikationen sættes ofte flere quadrupoler i serie og der indføres en kollision med gas undervejs i detektionen. Derved opnås et fragmentationsmønster, som kan give yderligere identifikationssikkerhed.

Non-target screening (herefter: NTS) anvender højopløsningsmassespektrometri (HRMS) som detektion i kombination med gaskromatografi eller væskekromatografi som separationseknik. Moderne tandem-massespektrometriinstrumenter med høj opløsning kombineret med ioniseringsteknikker til væske- og gaskromatografi (LC-HRMS, GC-HRMS) tillader påvisning af tusinder af forbindelser i en prøve, forudsat, at forbindelserne er kompatible med de ekstraktion-, separation- og ioniseringsprincipper, som anvendes. Det betyder, at tusindvis af stoffer i princippet kan detekteres samtidigt med høj følsomhed, inklusive stoffer, der aldrig er blevet identificeret før.

For at kunne udnytte potentialet for non-target analyser fuldt ud, forudsætter det anvendelse af teknikker som f.eks. QTOF eller Orbitrap.

Ved QTOF og Orbitrap detekteres de enkelte stoffers eksakte masser. Detektionsprincipperne er forskellige for QTOF og Orbitrap, men for begge gælder, at de modsat quadrupolen ikke måler på et enkelt m/z forhold ad gangen, men derimod på alt inden for et defineret område (f.eks. 100-1500 m/z).

Begge teknikker tillader markant bedre adskilles af masser, hvorved det er muligt at bestemme masser markant mere præcist (ofte <0,001 m/z præcision).  Ud fra den eksakte masse er det muligt at estimere en kemisk sumformular og heraf udlede en kemisk struktur. Det er desuden muligt at sammenligne de opnåede data med store internationale databaser eller computer simulerede spektraer for at sandsynliggøre sikkerheden på identifikationen.

Niveauer af sikkerhed ved non-target analyser

Det er vigtigt at være opmærksom på, at dette ikke er nogen garanti for, at det rent faktisk er det pågældende stof, som er fundet og en verifikation vil ofte kræve yderligere analyser, retentionstidsbestemmelse og evt. tilgang til et referencemateriale.  Man opererer derfor i praksis med forskellige niveauer af sikkerhed, når det drejer sig om NTS analyser. Nedenstående tabel viser en systematik for sikkerhed ved identifikation ved NTS, som blev foreslået af Schymanski et al (2014).

Egentlig kvantifikation i den kvalitet vi kender fra target-analyser forudsætter en referencestandard med kendt indhold, dvs. niveau 1 i overstående figur. Stoffer identificeret på baggrund af suspekt screening eller non-target analyser vil normalt ikke kunne kvantificeres med samme sikkerhed og kvantifikationen vil typisk være semi-kvantitativ. Det kan dog i mange tilfælde være tilstrækkelig i forhold til en prioritering af identificerede forurening.

Rene NTS analyser kan derfor være forbundet med en betydelig usikkerhed, hvis data alene tillader identifikation på niveau 2-5. For non-target analyser er dataanalysen, som inkluderer detektion, (semi)kvantificering og identifikation af stoffer, den største udfordring.

I praksis søger man at styrke datakvaliteten og sikkerheden i konklusionerne for den enkelte prøve ved at inddrage viden om de stoffer, som man kan støde på i den matrice, man står med. Ved at sammenfatte mange undersøgelser er der i dag opbygget såkaldte Suspekt Screeningslister, som typisk består af flere tusinde stoffer, som man har erfaring med kan optræde i eksempelvis spildevand, hvis det er den matrice, som er i spil. Her kommer NTS teknikkerne til sin ret, idet f.eks. QTOF apparater kan håndtere meget store suspect Screeningsanalysepakker uden at sætte følsomheden overstyr – noget som ellers gør sig gældende ved andre analyseplatforme som f.eks. traditionelle MS systemer.

Man kan nogen gange se suspect screeningspakker benævnt som ”known unknown”, som udtryk for, at der analyseres for ukendte men plausible/sandsynlige stoffer, mens rene non-target analyser uden forudgående kendskab til historik, matrice etc. kaldes ”unknown unknowns”.

Suspect screening af eksempelvis pesticider forudsætter, at der opbygges analysemetoder med tilhørende stof-biblioteker, som er målrettet de relevante pesticider. Metoderne vil desuden – afhængig af de enkelte stoffer – have en udfordring i forhold til kvantificering. Det kan være nødvendigt at gennemføre efterfølgende target-analyser med referencestandarder for at nå de analysekvaliteter mht. specielt usikkerheder på kvantifikation, som kendes fra eksempelvis pesticidområdet i dag. Det skal dog pointeres, at udviklingen i dag går mod stadigt mere følsomme analysesystemer.

En anden vigtig fordel ved HRMS-data sammenlignet med MS/MS-data med lav opløsning er, at et digitalt arkiv med HRMS-analyser med fuld scanning og HRMS/MS-spektre kan udnyttes med ”tilbagevirkende kraft”, hvis der opstår nye bekymringer eller ny viden om specifikke stoffer. Det er således muligt at lave retrospektive analyser af prøver, som er indsamlet og analyseret tidligere alene ved en re-analyse af data-filerne.

Hvor kan metoderne med fordel bruges på miljøområdet?

Som nævnt tidligere er disse HRMS analyseplatforme på vej ind i miljøområdet. Flere steder i udlandet bruges de allerede i dag rutinemæssigt eksempelvis til overvågning for miljøfremmede stoffer i Rhinen.

Teknikkerne kan bruges til target-analyser på helt samme måde, som det allerede sker i dag, men tilbyder også en række andre muligheder, som enten slet ikke har været muligt tidligere eller som være så omkostningskrævende, at det i praksis ikke har være realistisk.

Tabellen herunder opstiller nogle eksempler på, hvor NTS teknikker med fordel vil kunne anvendes fremover. Der skal fortsat udvikles på området og nye applikationer vil sandsynligvis vise sig fremover efterhånden som laboratorierne og vores kunder lærer teknikkerne at kende.

Teksten er skrevet af Kristoffer Kilpinen, PhD studerende hos Eurofins Miljø samt Peter Mortensen, Research and Development Manager. 

Webinarer

Tilmeld dig vores nyhedsbrev